ในภาคนี้ อินเดียนา โจนส์ (รับบทโดย Harrison Ford) ถูกส่งไปตามหาศิลาจารึกที่มีชื่อว่า “Holy Grail” หรือ “ถ้วยศักดิ์สิทธิ์” ซึ่งเชื่อกันว่าเป็นถ้วยที่ใช้โดยพระเยซูในงานเลี้ยงอาหารค่ำสุดท้าย
เรื่องราวเริ่มต้นเมื่ออินเดียนาได้รับข่าวว่า พ่อของเขา (รับบทโดย Sean Connery) ซึ่งเป็นนักโบราณคดีที่ศึกษาเกี่ยวกับ Holy Grail ถูกลักพาตัวไปโดยกลุ่มนาซีที่ต้องการศิลาจารึกนี้เพื่อใช้ประโยชน์ในสงคราม
อินเดียนาต้องร่วมมือกับพ่อของเขาและ อัลล่า (รับบทโดย Elsa Schneider) เพื่อหยุดยั้งแผนการของนาซีและค้นหาศิลาจารึกที่มีอำนาจลึกลับ
