เรื่องราวติดตาม Larry Daley (รับบทโดย Ben Stiller), ชายหนุ่มที่มีความฝันอยากจะประสบความสำเร็จในชีวิต แต่กลับต้องเผชิญกับความล้มเหลวและการเปลี่ยนแปลงหลายอย่าง เมื่อต้องหางานใหม่ เขาได้สมัครงานเป็นยามรักษาความปลอดภัยที่ American Museum of Natural History
เมื่อ Larry ทำงานในตอนกลางคืน เขาพบว่าผลงานจัดแสดงทั้งหมดในพิพิธภัณฑ์มีชีวิตขึ้นมาหลังพระอาทิตย์ตก! สิ่งมีชีวิตต่าง ๆ เช่น ไดโนเสาร์, นักรบโรมัน, และมัมมี่ กลับมามีชีวิตและสร้างความวุ่นวายภายในพิพิธภัณฑ์
การผจญภัยเริ่มต้นเมื่อ Larry ต้องเรียนรู้ที่จะจัดการกับความยุ่งเหยิงนี้ และสร้างความสัมพันธ์กับตัวละครประวัติศาสตร์ต่าง ๆ ในขณะที่ต้องหยุดยั้งแผนการชั่วร้ายจาก Dexter (ลิง) และทีมงานเพื่อรักษาความสงบในพิพิธภัณฑ์
