เรื่องราวเริ่มต้นเมื่อ Larry Daley (รับบทโดย Ben Stiller) หลังจากที่ได้มีบทบาทสำคัญในการทำงานที่ American Museum of Natural History ในภาคแรก ตอนนี้เขาได้ตัดสินใจที่จะทำธุรกิจใหม่ในฐานะนักประดิษฐ์และผู้ประกอบการ
อย่างไรก็ตาม เมื่อเขาได้เรียนรู้ว่าการจัดแสดงของพิพิธภัณฑ์ถูกอัปเกรดด้วยเทคโนโลยีใหม่ ๆ และเพื่อน ๆ ของเขาในพิพิธภัณฑ์ต้องเผชิญกับความเสี่ยงจากการถูกเก็บรักษาในรูปแบบถาวร Larry จึงต้องกลับไปช่วยเหลือพวกเขา
เขาต้องเดินทางไปยัง Smithsonian Institution ในวอชิงตัน ดี.ซี. ที่ซึ่งมีการจัดแสดงที่มีชีวิตขึ้น และต้องเผชิญหน้ากับคู่ต่อสู้ใหม่ เช่น Kamunrah (รับบทโดย Hank Azaria) ซึ่งมีแผนที่จะใช้พลังของวัตถุโบราณเพื่อควบคุมโลก
