หลังจากเหตุการณ์ในภาคแรก Peter Parker (Tobey Maguire) ต้องเผชิญกับความยากลำบากในการรักษาสมดุลระหว่างชีวิตส่วนตัวและการเป็นซูเปอร์ฮีโร่ Spider-Man เขาพบว่าความรับผิดชอบในการต่อสู้กับอาชญากรรมทำให้ชีวิตส่วนตัวของเขาเสียหาย โดยเฉพาะความสัมพันธ์กับ Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) ที่เขายังคงรักอยู่
ในระหว่างนี้ Dr. Otto Octavius (รับบทโดย Alfred Molina) นักวิทยาศาสตร์ผู้มีชื่อเสียง กลายเป็นศัตรูของ Peter หลังจากที่เขาประสบอุบัติเหตุจากการทดลองทำให้เขาได้รับแขนกลที่ควบคุมด้วยสมอง ซึ่งทำให้เขากลายเป็น Doctor Octopus (Doc Ock) Peter ต้องต่อสู้กับความกลัวและความรู้สึกผิดในขณะเดียวกันก็ต้องปกป้องเมืองจากภัยคุกคามที่ยิ่งใหญ่
