ในภาคนี้, Peter Parker (Tobey Maguire) กำลังประสบความสำเร็จในฐานะ Spider-Man แต่ก็เผชิญกับความท้าทายใหม่เมื่อความเข้มแข็งของเขาเริ่มส่งผลกระทบต่อความสัมพันธ์ของเขากับ Mary Jane Watson (Kirsten Dunst)
ในขณะที่ Peter พยายามจะต่อสู้กับอารมณ์ที่เกิดจากความสำเร็จและความสงสัยในตัวเอง เขาได้พบกับศัตรูใหม่ ได้แก่ Sandman (รับบทโดย Thomas Haden Church), ซึ่งมีความสามารถในการเปลี่ยนร่างเป็นทราย และเป็นผู้ที่เกี่ยวข้องกับการตายของอธิบดี Uncle Ben
นอกจากนี้, Peter ยังต้องเผชิญหน้ากับ Venom (รับบทโดย Topher Grace), ซึ่งเป็นผลมาจากการผสมผสานระหว่างตัวตนของ Peter และความรู้สึกแค้นที่เกิดขึ้น ทำให้ Peter ต้องต่อสู้กับความมืดในตัวเองและการต่อสู้กับศัตรูที่มีอำนาจมากขึ้น
