เรื่องราวติดตาม Miles Morales (ให้เสียงโดย Shameik Moore), วัยรุ่นที่อาศัยอยู่ใน บร็องซ์ ซึ่งได้รับพลังจากการถูกแมงมุมกัด ทำให้เขาได้กลายเป็น Spider-Man คนใหม่ หลังจากที่เขาได้เห็น Peter Parker (ให้เสียงโดย Jake Johnson) สไปเดอร์-แมนรุ่นเก่า ถูกฆ่าตายโดย Kingpin (ให้เสียงโดย Liev Schreiber) ขณะพยายามใช้เครื่องมือที่สร้างขึ้นเพื่อเปิดประตูไปยัง Spider-Verse (จักรวาลแมงมุม)
Miles ต้องเรียนรู้วิธีการเป็นสไปเดอร์-แมน และเมื่อมีสไปเดอร์-แมนจากจักรวาลอื่น ๆ เช่น Spider-Woman (ให้เสียงโดย Hailee Steinfeld), Spider-Man Noir (ให้เสียงโดย Nicolas Cage), Peni Parker (ให้เสียงโดย Kimiko Glenn), และ Spider-Ham (ให้เสียงโดย John Mulaney) มาช่วยเขาในการต่อสู้กับ Kingpin และปกป้องโลกจากภัยคุกคามที่เกิดจากการเปิดประตูของ Spider-Verse
